编辑|星星
?——【 ·前言· 】——?
整合素在不同构象下对其配体表现出不同的亲和力，当适配器蛋白Talin1和Kindlin-3直接结合到整合素β亚基的细胞质结构域时，血细胞整合素被激活。
然而白细胞β2整合素的激活依赖于Rap1/RIAM/Talin1途径，但在RIAM敲除小鼠中，整合素依然正常激活，这暗示存在RIAM非依赖性的Talin1募集途径。
我们对Talin1进行了Rap1结合缺陷敲入小鼠的全面分析。
而实验结果显示，Rap1/Talin1相互作用的破坏，降低了Talin1对质膜的募集，导致体外整合素的活化和信号传导的减少，证实了这种相互作用在体内对血小板和中性粒细胞功能的重要性。
?——【 ·血小板体外测定· 】——?
在实验中，我们对血小板的活化、聚集、扩散以及血小板丝状肌动蛋白含量进行了测定，实验中使用了10μg/mL的原纤维胶原蛋白，将其包被在Ibidiμ-SlidesVI0.1（Horm，Takeda Austria GmbH）上进行，其中包括涂层组和未涂层组两组条件。
随后将肝素化的血液灌注进入腔室中，持续4分钟，以1000/s的剪切速率使用Tyrode溶液进行洗涤。
在实验中，配备了1×NA20.0物镜和AxioCamMRm进行染色后的图像拍摄，后续使用了配备75NA物镜和AxioCamMRm进行染色后的图像拍摄，使用ImageJ软件对图像进行处理，测量表面覆盖率，并根据血小板计数进行了归一化处理。
?——【 ·微血管血栓形成· 】——?
在实验中，我们通过腹膜内注射混合了100mg/kg氯胺酮和10mg/kg木拉嗪的混合麻醉药物，对小鼠进行了麻醉。
随后逆行插入导管到左股动脉，并施用带有异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖以及针对GPIbβ的DyLight649标记抗体，以便进行血小板的可视化。
在小鼠右侧腹侧切口暴露下操作提肌，将睾丸和附睾从提肌上分离出来，在整个体内显微镜测量的过程中，提肌不断被温热的缓冲盐水灌注。
接下来使用光化学损伤的方法诱导微血管中的血栓形成，通过动脉内输注2.5%的异硫氰酸荧光素-葡聚糖溶液，并在488nm的波长下，向待研究的暴露血管段提供连续的光照，使用配备Colibri2LED光源的AxioScope.A1显微镜进行荧光显微镜下的观察，以可视化微血管中的血栓形成。
每次实验在三个小静脉和一个小动脉（内径为20-30μm）中诱导血栓形成，记录了血栓形成的开始时间（第一个血小板粘附的时间）和血流停止的时间（血管完全阻塞的时间）。
在研究大血管中的血栓形成过程中，我们使用无菌手术刀片横截小鼠尾巴，位置位于距离尾巴尖5毫米处。
随后将小鼠的尾巴浸入温热的缓冲盐水中（37°C），并监测尾部出血情况，直至出血停止，出血停止时间超过6秒，并记录了出血情况，最长记录时间为15分钟。
?——【 ·白细胞体外检测· 】——?
本次实验使用EasySep小鼠中性粒细胞富集试剂盒（干细胞技术），从骨髓中分离出中性粒细胞，
为了进行体外测定，我们使用骨髓源的巨噬细胞。
将这些细胞培养在含有164%胎牛血清、10U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、100μMβ-巯基乙醇和巨噬细胞集落刺激因子的RPMI50培养基中，培养持续6天，以实现细胞的分化。
随后使用未包被的μ-SlidesVI0.4（Ibidi）载玻片，这些载玻片涂覆有12.5μg/mL的重组细胞间粘附分子1（ICAM-1）。
接着提取每毫升分离自骨髓中的中性粒细胞悬浮液3×106个，使用EasySep小鼠中性粒细胞富集试剂盒（干细胞技术）进行分离，用CellTraceCFSE细胞增殖试剂盒对每个细胞进行染色。
?——【 ·小鼠实验体· 】——?
我们在进行活体显微镜检查前的前5小时，通过阴囊内注射2ng的TNF-α来处理小鼠，然后对其进行麻醉，使用水浸物镜为20×40.51NA的BX40WI显微镜和奥林巴斯CCD相机（CF0/80，κ），记录了直径为8至1μm的毛细血管后小静脉的薄膜。
在实验结束后采集了小鼠血液样本，并使用ProCyteDx血液学分析仪测定了白细胞和中性粒细胞的计数。
基于斐济软件，我们计算了白细胞的滚动通量分数（通过血管的所有白细胞中滚动白细胞的百分比）、滚动速度、粘附和粘附效率（每毫米贴壁细胞数除以系统性中性粒细胞计数）。
接着使用4%多聚甲醛固定提睾肌肉，并进行吉姆萨染色，在生物成像核心设施中使用徕卡DM3显微镜配备DMC2500CMOS相机和HCXPLAPO2900×/100.1OilPh40进行了评估。
?——【 ·Tln1中的整合素活性· 】——?
考虑到Talin1和Rap1在血小板中表达水平较高，而RIAM的表达较低，我们假设直接的Rap1/Talin1相互作用在血小板整合素活性中具有特殊重要性。
通过测定Kindlin-3、RIAM和Rap1的表达水平，以及整合素的表面表达水平，我们发现这些因子在野生型（WT）血小板和Tln1缺失血小板之间存在相似性。
在这种情况下，使用构象特异性的JON/A-PE抗体来测量激动剂诱导的αIIbβ3整合素活化，对WT和Tln1的血小板进行了比较。
实验结果显示，在高浓度凝血酶或其他激动剂（如ADP、U46619和胶原相关肽）刺激下，WT和Tln13mut血小板产生了类似的反应。
然而当凝血酶或其他激动剂浓度较低时，Tln13mut血小板的整合素活化相较于WT对照组表现出降低的敏感性，这暗示Tln1在较低浓度激动剂刺激下的整合素活化能力降低。
但当在与AlexaFluor647结合的纤维蛋白原的存在下，Tln13mut血小板在高浓度激动剂刺激时表现出相似的聚集反应。
低浓度激动剂刺激下显示出聚集的缺陷，进一步测试了α2β1整合素活化是否在Tln13mut血小板中降低，观察到对流动下的胶原蛋白的血小板粘附显著降低。
我们还进行了对Tln13mut血小板在纤维蛋白原上的粘附和扩散的实验，结果显示Tln13mut血小板在粘附和扩散方面存在缺陷。
通过测量扩散面积随时间的变化，发现Tln13mut血小板的扩散速率较慢，这是由于肌动蛋白聚合的减少所引起的，这表明整合素外向内信号传导在Tln13mut血小板中也受到显著影响。
?——【 ·Rap1/Talin1相互作用· 】——?
为了探究体内血小板中Rap1/Talin1相互作用丧失是否与某种生理相关性，我们对Tln1^3mut小鼠进行了止血能力的测试。
结果显示与WT小鼠相比，Tln13mut小鼠的出血时间明显延长。
此外我们还对WT和Tln1小鼠的睾丸肌肉血管系统进行了研究，使用光毒性诱导的血管损伤来观察病理性血栓的形成。
在这个实验中，标记了血小板，并通过活体显微镜记录了血栓开始形成并最终阻塞血管的时间。
虽然Tln13mut血小板在受损血管壁上的附着存在延迟趋势，但Tln13mut小鼠在双侧小静脉和小动脉中的血管闭塞时间显著延长。
与对照小鼠相比，这些观察结果明确表明，直接的Rap1/Talin1相互作用在调节体内血小板功能中具有关键作用。
?——【 ·多形核白细胞· 】——?
在研究Rap1/RIAM/Talin复合物在白细胞整合素的激活作用时，我们发现Talin1/Rap1相互作用的丧失会影响白细胞整合素的功能。
基于这个发现，我们分离了多形核白细胞（PMN），并在佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）中进行了粘附测定。
但让我们意外的是，检测结果显示，Tln13mut与WT对照相比，在粘附到整合素配体ICAM-1、α4β1整合素配体血管细胞粘附分子1（VCAM-1）以及纤连蛋白（作为几种整合素的配体）的PMN上，粘附显著降低。
总之Talin1和其他整合素调节蛋白（如Rap1、Kindlin-3和RIAM）在细胞内表达方面相似，WT和突变PMN之间的表面整合素水平也相当。
为了测试Tln1的粘附能力是否由于粘附强化的缺陷而降低，我们从对照和Tln1小鼠的骨髓中分离了PMN，将它们接种在ICAM-1包被的流动室上，用TNF-α激活它们，并在腔室中逐步增加剪切应力（分离测定）。
我们进行了血液中细菌吞噬能力的测量，发现Tln13mutPMN吞噬细菌的能力显著降低，与对照PMN相比，这些数据强调了直接Rap1/Talin1相互作用在调节中性粒细胞整合素功能方面的关键作用。
?——【 ·结论· 】——?
在这项实验中，我们使用了具有Rap1结合缺陷的Talin1敲入小鼠模型，研究Rap1/Talin1相互作用在整合素信号传导中的功能，基于这些结果，表明Tln13mut小鼠在发育、活力和表面健康方面均表现正常。
实验中从Tln1中分离出的MEF3mut小鼠展现出正常的整合素功能，说明Talin2的功能补偿作用。
Tln13mut小鼠的β1整合素活性下降，巨噬细胞并未出现粘附或扩散缺陷，这表明直接的Rap1/Talin1相互作用在循环细胞，如血小板和中性粒细胞中尤为关键，这些细胞需要快速而动态的整合素介导反应。
我们的数据充分证明了直接的Rap1/Talin1相互作用对于调节生理环境中的整合素信号传导的作用机制。
参考文献
【1】渡边，《重建和解构激动剂诱导的整合素αIIbβ3激活》
【2】潘迪M，《.激动剂诱导的talin募集到血小板整合素αIIbβ3的机制》
【3】林CJ，《MH.RIAM通过将talin与rasGTPase膜靶向序列连接来激活整合素》
【4】拉加里格F，《.RIAM/片状足素-他林-整合素复合物形成指导细胞迁移的粘性手指尖》
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