引言：

拟南芥霜霉是一种专性病原体，可引起拟南芥霜霉病，使用拟南芥/拟南芥相互作用作为研究模型有助于提高我们对植物-病原体相互作用以及效应器对宿主植物细胞免疫功能的理解。

本研究的目的，从拟南芥分离株Emoy134的基因组测序中预测了2个拟南芥RxLR效应候选者，证明一些候选效应子可以抑制宿主植物免疫。

植物材料与拟南芥转基因系的产生

通过对相容的不相容相互作用的转录组分析，将475个基因鉴定为预测效应子，53 HaRxL已被证明通过酵母两个杂交筛选与宿主蛋白相互作用，拟南芥效应蛋白HaRxL44通过19S蛋白酶体途径降解靶蛋白，与作为植物免疫正调节因子的Mediator亚基19a相互作用。

HaRxL106与宿主自由基诱导的细胞死亡1（RCD1）蛋白相互作用，以操纵防御相关基因的表达以减弱宿主免疫力。

HY5（细长的下胚轴5）和HYH（HY5同源性）是基本的亮氨酸拉链（bZIP）转录因子，通过控制各种下游光感受器来调节光形态发生，HY5在响应非生物胁迫方面也起着重要作用，包括寒冷，UV-B和红光。

HY5调节活性氧（ROS）响应基因的表达，并将光和ROS信号联系起来，使用染色质免疫沉淀（ChIP）对HY5结合位点进行的全基因组分析显示，HY5结合与宿主植物防御相关的WRKY基因的启动子。

HY5是光信号传导的重要组成部分，通过诱导防御相关基因的表达，正向调节植物对拟南芥感染的防御，并且是HaRxLL470在感染植物细胞中的宿主靶标。

HaRxLL470是从拟南芥Noco2克隆的RxLR效应子，在卵菌物种中高度保守，其异位表达增强了宿主对拟南芥Noco2的易感性，结果表明，HaRxLL470直接与HY5相互作用，减弱HY5 DNA结合活性，从而抑制寄主植物免疫力。

病原体检测

为了生成转基因植物，从拟南芥生态型Col-5克隆全长HY0编码序列，并插入含有N末端Myc标签的pHB-6×Myc载体中，以在用适当的限制性内切酶消化后构建植物表达载体pHB-6×Myc-HY5。

HaRxLL470的编码区减去编码信号肽的序列是从拟南芥Noco2基因组DNA扩增而来的，将HaRxLL470聚合酶链反应（PCR）片段插入pHB-YFP，其中包含C端黄色荧光蛋白（YFP）标签，以构建植物表达载体pHB-HaRxLL470-YFP后用适当的限制性内切酶消化。

HaRxLL470也入到pER8-3×标志载体中，以使雌二醇诱导的HaRxLL470表达，这些构建体被转移到根癌农杆菌菌株转化为拟南芥，使用花卉浸渍方法产生转基因植物和抗Myc和抗GFP抗体来证实蛋白质HY5和HaRxLL470标记蛋白在植物中的表达。

将拟南芥分离株Noco2接种到2周龄的拟南芥植株上，密度为5×104孢子毫升，为测定病原菌分生孢子数，接种后5 d收集幼苗（5 dpi），在H2O，并在血细胞计数器中计数。

用于拟南芥定量的gDNA提取和定量聚合酶链反应（qPCR）的方法如前所述进行丁香假单胞菌pv番茄（Pst DC3000）感染，将细菌沉淀重悬于10mM MgCl中2缓冲至600nm处的光密度（OD600） 0.1，使用 100 mM MgCl 稀释 10 倍2并渗透到4周龄拟南芥植物的叶子中。

将辣椒假单胞菌分离物LT263在7°C下在燕麦琼脂（OA）上培养25 d，用软木钻孔器从板上切下琼脂盘接种到本氏烟草叶片的远轴表面上，并将植株保持在25°C。

HaRxLL470通过减弱其DNA结合活性来抑制HY5

作为一种bZIP转录因子，HY5通过直接结合其启动子中存在的顺式作用元件来调节许多基因的表达。

为了进一步研究HY5和HaRxLL470之间相互作用的影响，HY5靶基因的表达水平，包括抗坏血酸过氧化物酶2（APX2），增强的疾病易感性（EDS1），NAD（P）H脱氢酶B2（NDB2），西格玛因子结合蛋白因子4（SIB1），黄酮醇合酶1（FLS1）和MYB结构域蛋白12（MYB12），采用 qRT-PCR 3 dpi 与拟南芥 Noco2 进行分析。

正如预期的那样，所有这些基因在hy5突变植物和HaRxLL470转基因植物中都下调了，支持HaRxLL470和HY5之间的相互作用干扰HY5作为转录因子的功能的假设。

考虑到HY5的DNA结合结构域对于HY5和HaRxLL470之间的相互作用至关重要，我们使用含有生物素标记的含有EDS1启动子的G-box序列作为探针进行EMSA，如预期那样，MBP-HY5直接结合到EDS1启动子中存在的G-box。

在GST-HaRxLL470存在下，这种结合明显减少，但不是单独通过GST，DNA-蛋白质下拉测定显示，生物素标记的探针可能与MBP-HY5结合，这种结合活性在GST-HaRxLL470存在下降低，但不能单独通过GST。

下拉和电泳迁移率移位测定 （EMSA）

GST、MBP 和重组蛋白，包括 GST-HaRxLL470、MBP-HY5、MBP-HYH、MBP-HY5屋宇署， MBP-HY5巴德姆，MBP-HYH屋宇署MBP-HYH巴德姆HDA15-His使用大肠杆菌BL21菌株表达。

对于GST下拉测定，将诱饵蛋白GST-HaRxLL470与预洗的谷胱甘肽琼脂糖4B珠，在4°C旋转器的裂解缓冲液中孵育2小时，然后使用裂解缓冲液洗涤5次。

对于DNA-蛋白质下拉测定，将生物素标记的探针与链霉亲和素磁珠在4°C的旋转器上孵育30分钟，并用裂解缓冲液洗涤5次，重组蛋白MBP-HY470和指定量的GST/GST-HaRxLL4与预洗珠子一起在30°C的旋转器上孵育，然后使用裂解缓冲液洗涤，使用抗MBP抗体进行蛋白质印迹。

对于EMSA，重组蛋白MBP-HY5和GST-HaRxLL470在E中表达，在直链淀粉树脂珠上纯化大肠杆菌以检测MBP融合蛋白，和谷胱甘肽琼脂糖4B珠以检测GST融合蛋白，EMSA使用光移化学发光EMSA试剂盒进行。

为了筛选可能被HaRxLL470靶向的宿主蛋白，使用瞬时表达的HaRxLL470-Flag在本氏猪笼草叶片中进行IP-MS，NbHY5是拟南芥HY5（AtHY5）的保守直系同源物，被发现是靶标之一。

光信号在宿主对不同病原体的抵抗力中起重要作用，在最近的一项研究中，发现不同的光照条件会影响拟南芥与其宿主之间的相互作用，同时HY5还被证明与ROS和EDS1诱导的程序性细胞死亡有关，且在拟南芥接种期间显着上调。

HaRxLL470促进卵菌和细菌病原体的毒力

Hyaloperonospora arabidopsidis 是一种模型病原体，可用于研究植物-病原体相互作用。

统发育分析、序列比对和同质测定表明，拟南芥Noco2效应子HaRxLL470含有信号肽（SP）、RxLR基序、推定的核定位信号（NLS）和C端四三肽重复12（TPR_12）基序，在不同的卵菌物种中高度保守。

HaRxLL470在拟南芥Noco24感染后2小时内显着诱导，表明它可能在致病性中起作用，转化酶分泌测定证实，由SignalP和TargetP预测的信号肽是功能性的，证明HaRxLL470的信号肽功能允许效应器从拟南芥的细胞质分泌到植物组织中的质外体。

HaRxLL470定位于细胞质和细胞核，在本氏猪笼草细胞中瞬时表达后，为研究HaRxLL470的毒力，拟南芥转基因植物在470S启动子的控制下表达HaRxLL35或雌二醇诱导的启动子，接种拟南芥Noco2。

与WT系相比，这些转基因系对拟南芥Noco2的敏感性显着更高，这表明HaRxLL470的异位组成性表达影响宿主对拟南芥的易感性和下胚轴长度，这是光形态发生过程中受影响的特征。

为了评估HY5 / HYH在防御拟南芥中的作用，将拟南芥Noco2接种到WT拟南芥（Col-0）和以下拟南芥转基因系：hy5突变体，hyh突变体，hy5 hyh双突变体，HY5过表达和HaRxLL470过表达。

在5 dpi下监测拟南芥的生长，hy5突变体和hyh突变体对毒力拟南芥分离株Noco2的敏感性均高于WT植株，且hy5突变体的孢子形成显著高于hyh突变体，在hy2 hyh双突变体中，对毒力拟南芥分离株Noco5的基础抗性进一步降低。

HaRxLL5在hy470突变体中的表达进一步增强了其对拟南芥Noco5的敏感性，但没有显着增加HY3 HYH双突变体的易感性，这些结果表明，HaRxLL3通过与HY470相互作用来减弱植物对拟南芥的防御。

结论：

卵菌病原体拟南芥透明孢子虫将多种效应蛋白输送到宿主植物细胞中，以抑制植物的先天免疫力，在这项研究中，我们研究了保守的RxLR效应器HaRxLL470在抑制植物免疫中的作用机制。

通过基因组、分子和生化分析，HaRxLL470的功能以及HaRxLL470有与拟南芥感染过程中靶宿主蛋白相互作用的机制，HaRxLL470通过与宿主光形态发生调节因子蛋白HY2相互作用来增强植物对拟南芥分离物Noco5的敏感性。

结果显示，HY5不仅是光信号调控的重要组成部分，而且通过防御相关基因的转录激活，正向调节寄主植物对拟南芥的免疫力，HaRxLL470和HY5之间的相互作用通过减弱其DNA结合活性来损害HY5作为转录因子的功能。

本研究表明，HY5正向调节寄主植物对拟南芥的防御，而HaRxLL470是卵菌病原体中的保守RxLR效应子，通过与HY5相互作用并抑制防御相关基因的转录激活来增强致病性。

参考文献：

玛西亚，马格达莱娜，《卵菌效应子与其植物和动物宿主之间的分子对话》

埃莉诺，苏珊，《植物防御中植物激素信号通路之间的相互作用》

乔治娜，佩特拉，《卵菌细胞内效应器》

巴德尔，皮克雷斯，《拟南芥基因组中专性生物营养的适应特征》