「文献速递」JEB | 一种研究miRNA及靶基因功能的新方法

2021年7月20日，福建省农科院生物技术研究所王峰和厦门大学陈亮课题组合作在Journal of Experimental Botany期刊上发表了题为“Employing CRISPR/Cas9 for de-repression of specific miRNA-target genes in rice”的研究论文 。该团队报道了一种基于CRISPR/Cas9技术研究miRNA靶基因精准去抑制的方法。

背景介绍

miRNAs是一类单链非编码RNAs，通常为20-24nt，它们通过特定的碱基配对机制与mRNA结合，以介导转录后的基因沉默。miRNAs已被证明参与许多生物过程，包括生长、发育、应激反应、激素信号传导等。

如何研究miRNA的功能呢?常见的几种研究方法如下：

1、靶标模拟技术（Target mimicry，MIM）

在拟南芥中有一个非编码蛋白基因IPS1，其转录的RNA能与miR399通过序列互补的方式特异性结合，但在miRNA的切割位点形成不完全互补的泡状结构，即miR399无法切割IPS1 RNA，从而抑制了miR399对其靶标PHO2基因mRNA的降解，反之则会促进PHO2 mRNA的降解 (Franco-Zorrilla et al., 2007) （图1）。

图1. MIM技术抑制miRNA的原理图 (Franco-Zorrilla et al., 2007)。IPS1相当于靶标模拟。

2、短串联靶标模拟技术（Short tandem target mimicry，STTM）

STTM技术是在MIM技术的基础上发展而来的 (Yan et al., 2012)。该技术的原理是人工合成一段短串联靶标模拟物，中间有一段48nt左右的特定核苷酸序列，两端分别含有目标miRNA结合位点，每段miRNA结合序列包括3个非互补碱基（CTA），该序列能与目标miRNA结合形成非完全互补双链，从而有效地阻止miRNA与目的基因的结合，使miRNA沉默，最终使目的基因的表达量升高（图2）。

图2. STTM165/166-48植株表现发育障碍 (Yan et al., 2012)。（A）STTM165/166-48的载体设计策略，橙色表示间隔区和间隔序列，蓝色表示miRNA结合位点的凸起序列。（B）与空载对照（Vector）、MIM165和phb-1d相比，STTM165/166-48植株的表型。MIM165：采用MIM技术构建的载体；phb-1d：PHB基因的显性遗传突变体。（C）与载体对照，MIM165和phb-1d植物相比，STTM165/166-48转化植株中靶基因PHB的qRT-PCR分析。（D）miR165/166的靶标基因是PHV、REV、ATHB-8、ATHB-15，检测这些靶基因的相对表达量，结果显示靶基因表达量均得到提高。

3、突变miRNA基因

基于CRISPR/Cas9技术使miRNA基因发生突变也是一种常用的方法（图3）。

图3. GRF基因结构和MIR396基因编辑的靶位点 (Miao et al., 2020)。

文献速览

在7月发表的这篇文献中，该团队的策略是：利用CRISPR/Cas9技术突变miR396在靶基因上的识别位点，使靶基因避免转录后受到miR396的抑制。为了评估该策略是否有效，该团队选择了受miR396调控的OsGRF4和OsGRF8基因，前者控制粒径，后者调控植株对褐飞虱的抗性。通过CRISPR/Cas9技术，成功地突变了miR396在靶基因上的互补序列，产生了缺失或插入长度为3碱基倍数的Osgrf4和Osgrf8突变体，分别导致粒径增大和对褐飞虱的抗性增强。因此，该团队的研究结果为利用CRISPR/Cas9研究miRNA功能提供了一种新策略，且这种方法在植物中比较容易实现。

图4. 利用CRISPR/Cas9技术突变miR396在OsGRF4基因上的识别位点 (Lin et al., 2021)。（a）OsGRF4基因的结构及miR396的识别位点；（b）突变体序列；（c）籽粒表型；（d）突变体中OsGRF4基因的相对表达量。

图5. T0代的双等位纯合突变体grf4-#25与其子代T1代有相同的性状，说明突变体性状能稳定遗传 (Lin et al., 2021)。

图6. T2代突变体表型及表型数据测定 (Lin et al., 2021)。

图7. 利用CRISPR/Cas9技术突变miR396在OsGRF8基因上的识别位点 (Lin et al., 2021)。

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References

Franco-Zorrilla JM, Valli A, Todesco M, et al., 2007. Target mimicry provides a new mechanism for regulation of microRNA activity. Nat Genet 39, 1033-7.

Lin Y, Zhu Y, Cui Y, et al., 2021. Employing CRISPR/Cas9 for de-repression of specific miRNA-target genes in rice. J Exp Bot.

Miao C, Wang D, He R, Liu S, Zhu JK, 2020. Mutations in MIR396e and MIR396f increase grain size and modulate shoot architecture in rice. Plant Biotechnol J 18, 491-501.

Yan J, Gu Y, Jia X, et al., 2012. Effective small RNA destruction by the expression of a short tandem target mimic in Arabidopsis. Plant Cell 24, 415-27.